Методы исследования заживления язвы желудка

Исследования проводились в период 2005-2008 гг. в отделе молекулярно-клеточных технологий, экспериментальной терапии и фармакологии ЦНИЛ Ташкентской медицинской академии (директор ЦНИЛ — д.м.н., проф. Бабаджанов). Исследования проведены на 150 беспородных белых крысах-самцах массой 180-240 г в трех сериях экспериментов. 1-ю серию составляли животные с перфоративной язвой, которую воспроизводили по методу Э.М.Байбековой. 2-ю серию исследований составили животные, которым на 10-е сутки язвенного процесса очищали дно, восполненное сальником, очищали от некротических тканей края язвенного дефекта до пределов нормальной ткани СОЖ, а затем непрерывным узловатым швом ушивали. 3-ю серию исследований воспроизводили путем одновременного ушивания язвенного дефекта с ТАМ. Для этого ТАМ заполняли в язвенный дефект, который как и во 2-й серии опытов предварительно очищали от некротических масс, а затем ушивали. Активность монооксигеназных ферментов, а также морфологические исследования проводили на 10, 20 и 30 сутки после ушивания перфоративной язвы.

Содержание цитохрома Р-450 (расчет вели по разнице величин поглощения при λ 450-490 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 91×10³ мМ.см^-1) и b₅ (по разнице величин поглощения при λ 490-424 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 163·10³ мМ.см^-1) в полученных микросомах определяли с использованием двулучевого спектрофотометра «Specоrd UV-Vis М40» (Германия) (Omura T., Sato R., 1964). Определение НАДФН-цитохром с-редуктазы (НАДФН-цит. с-ред.) проводилось по методу (Williams C.H, Kamin H. 1961) с использованием коэффициента молярной экстинкции 22·10³ мМ.см^-1.Аминопириндеметилазную (NA) активность определяли спектрофотометрически на СФ-46 (Россия) по (Bast A., Nordhook J. 1981) с использованием коэффициента молярной экстинкции 7,6·10⁶ мМ.см^-1. Анилингидроксилазную (АГ) активность (НАДФН-зависимую) определяли по (Арчаков А.И и соавт., 1975) с использованием коэффициента молярной экстинкции 9,46·10⁶ мМ.см^-1. Активность фермента бенз(а)пиренгидроксилазы (Б(а)ПГ) определяли по методу (C.H.Yang, L.P.Kicha, 1978) на спектрофлюориметре Hitachi MPF-4 (Япония) при длине волны поглощения 350 и эмиссии 286 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 15·10⁵ мМ.см^-1. Определение глюкозо-6-фосфатазы (Г-6-Фаза) по методу (N.C.Gnoch, N.C.Kar, 1983) на спектрофотометре СФ-46 с использованием коэффициента молярной экстинкции 32,3·10⁶ мМ.см^-1.

Структурные изменения фосфолипидного матрикса микросомальных мембран оценивали с использованием флуоресцентных зондов. Параметры связывания флуоресцентного зонда 1,8-АНС^- определяли по методу (Владимирова Ю.А, Добрецова Г.Е., 1980). Рассчитывали константу связывания (Кс), концентрацию центров связывания (N) и суммарное сродство зонда (КсN) методом двойных обратных величин. Зонд готовили на 40 мМ трис-HCl буфере рН 7,4. Мембраны (концентрации 0,5 мг/мл) титровали зондом в диапазоне концентраций от 5 до 40 мкМ. Титрование 1,8 АНС^- (40 мкМ) мембранами микросом проводили в интервале конечных концентраций 0,1-0,6 мг/мл. Флуоресценцию 1,8 АНС^- регистрировали на спектрофлуориметре Hitachi MPF (Japan) при длине волны возбуждения 365 нм и флуоресценции 490 нм.

Результаты пересчитывали на содержание (мг) микросомального белка, который определяли по методу (Lowry и соавт., 1951), используя в качестве стандарта раствор бычьего сывороточного альбумина.

Контролем для всех групп исследований служили интактные животные.

В отдельной серии исследований проведены опыты in vitro по изучению диагностической ценности N-АП в желудочном соке после ушивания перфоративных язв у 48 больных в возрасте 18-56 лет. Ушивание перфоративных язв проводили по Островскому и Опелю-Поликарпову. В 1-ю группу включены 23 пациента, получавших ингибиторы протонной помпы и блокаторы Н₂-гистаминовых рецепторов, антихеликобактериальные препараты, средства, ускоряющие репаративные процессы и дающие цитопротекторный эффект, во 2-ю — 25 больных, не принимавших такого лечения. Регулярно каждые 6 месяцев в амбулаторных условиях, наряду с другими биохимическими исследованиями определяли рН желудочного сока (при рН 0,9-1,1 состояние кислотопродукции оценивали как гиперацидное, 3,0-4,5 — гипоацидное, 5,5-6,5 — нормацидное), обсемененность СО антрального отдела желудка и двенадцатиперстной кишки Helicobacter pylori оценивали по методу (Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрактол. Метод.рекоменндации 11с, 1998), а активность N-АП желудочного сока по (А.С.Комарину, 1994). В качестве контроля служили данные, полученные до ушивания перфоративной язвы, а также 20 условно здоровых добровольцев без признаков поражения СОЖ по данным эзофагогастродуоденоскопии и рН желудочного сока в пределах нормы (5,8-6,5).

Морфологические исследования проведены под руководством зав. гистологическим отделом ЦНИЛ ТМА д.м.н., проф. Э.М.Байбековой.

Стенка желудка в области раневого дефекта разрезалась острой бритвой на кусочки общей площадью 5×5 мм, после чего ткань фиксировалась в растворе формалина (Карнуа). Готовили серийные срезы толщиной 5-6 мк, из которых отбирали 5-6 срезов, прошедших по центру раневого дефекта, с обязательным наличием обоих краев раны. Срезы обрабатывали общеморфологическими (гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону) и электронно-микроскопическими методами исследования.

Для трансмиссионной микроскопии (ТЭС) кусочки слизистой фиксировали в 8,6% растворе на глютаровом альдегиде, заливали в смесь эпон-аралдита. Срезы изготавливались на ультратоме LКВ, контрастировались уранил-ацетатом и просматривались в электронном микроскопе Хитачи-600.

Для сканирующей микроскопии образцы после общепринятой фиксации денатурировали и высушивали методом перехода через критическую точку закиси азота в аппарате НСР-2 Хитачи, монтировали на алюминиевые подложки. После напыления золотом образцы просматривали и фотографировали в сканирующем электронном микроскопе Хитачи 405 А.

Электронно-микроскопические исследования проведены в лаборатории патоморфологии НХЦ МЗ РУз (зав. лабораторией — д.м.н., проф. И.М.Байбеков).